《醋酸奥曲肽的固相合成》，

刘作家，吉林大学生命科学学院

由于奥曲肽的 C-末端残基系醇羟基，所以在固相肽合成时首要解决的问题是醇羟基的制备。由于N-保护苏氨醇的价格较为昂贵，考虑到原料药的生产成本，在合成工艺研究中对N-保护苏氨醇采取了自制的方法来获得。文献[11, 42]报道了使用BH3/THF 还原N-保护氨基酸羧基来制备氨基醇的方法。在该法中 ，还原试剂BH3/THF 价格较为昂贵且反应条件苛刻，实验操作中难以控制，产品收率较低，不利于产品的商业化生产。N-保护的氨基醇通过LiAlH4 还原的方法来制备，产品收率较低，产物分离困难且N-保护基容易脱除[11]。使用NaBH4 制备N 端无保护的氨基醇的方法已有报道，而对于Fmoc-保护氨基醇的制备方法未见报道。本文针对使用BH3/THF 制备氨基醇不理想的情况，对NaBH4 的还原方法进行了系统的研究，并得到了较好收率的Fmoc-氨基醇（93%），为N-保护氨基醇的制备提供了新方法，在奥曲肽的生产工艺中具有创新性。对于C-末端醇羟基的固相肽合成，固相载体的选择成为了关键。Escher, E 等[43]报道采用氯甲基化树脂，以醇羟基与琥珀酸酐形成的琥珀酸酯为把手，使用Boc-TFA-HF 保护基系统的固相肽合成战略合成了C-末端为醇羟基的多肽醇类化合物。在这一合成方案中，由于使用了HF 作为树脂肽的切脱试剂，增加了实验操作的危险性，而在工业化中更难以实现；同时，由于琥珀酸酯的存在，最后还需要皂化以得到肽醇，增加了实验步骤。Fields,G.B[44] 报道分别采用Fmoc-Thr(t-Bu)-HMP 和Fmoc-Thr(t-Bu)-HMPB 树脂为载体，使用Fmoc-哌啶保护基系统和NaBH4/LiBr 还原肽树脂的固相肽合成战略合成奥曲肽衍生物，但收率较低（8%）。在苏氨醇的分子结构中含有两个醇羟基，可以与醛基形成缩醛化合物，而缩醛化合物在碱性条件下稳定，在酸性条件下非常容易还原为原来的醇。据此，在本文的合成工艺中，采用了AM 树脂为载体, 使用对-羧基苯甲醛与苏氨醇缩合而成的缩醛化氨基酸衍生物为把手及Fmoc-哌啶保护基系统的固相肽合成战略合成奥曲肽。最后，使用TFA 溶液作为侧链保护基及树脂肽的切脱试剂，并同时酸解缩醛化合物来制备奥曲肽。根据多肽的合成设计思想，α-氨基与侧链官能团采取交叉保护的原则，在奥曲肽的固相合成工艺中，各氨基酸的α-氨基均使用Fmoc 保护基，各氨基酸的侧链采取了最大保护策略。半胱氨酸的侧链巯基的保护在多肽合成中一直是引人注意的问题。因为含有二硫键的胱氨酸肽在化学合成中涉及到两个氨基和两个羧基的选择性保护的问题，比较困难。在本文的设计中，使用了Trt 作为侧链巯基的保护基，因为该保护基对碱稳定，在TFA和助脱剂的存在下容易脱除；其它保护基，如Bzl 和t-Bu 对TFA 则完全稳定。苏氨酸的羟基一般可以不加保护，但在固相合成反应中，由于采用了大过量的羧基组分，也会发生由于羟基所带来的副反应，因此，对羟基进行预先的保护较为适宜。在本文的设计中，使用了t-Bu 作为羟基的保护基，因为该保护基对碱稳定，而能用TFA 室温酸解条件下脱除；而对于Bzl 保护基却对TFA 稳定。赖氨酸的ε-氨基是必须加以保护的，但由于ε-氨基的保护在肽链合成过程中并不需要选择性地脱除，而只是在肽链的合成完成后才除去，因此一般选用在脱除其它保护基时都不会被脱除的保护基。在本文的设计中，ε-氨基使用了Boc 基保护，因为该保护基对碱稳定，却更易被TFA 除去；而对于其它保护基则需要更强的酸如HF或催化氢解才能脱去，不利于实验室操作。色氨酸的吲哚环使用了Boc基保护，因为该保护基对碱稳定，却更易被TFA 除去；甲酰基保护基能用哌啶脱去，不符交叉保护的原则。酰胺键的形成使用了DCC 法。在酰胺键形成过程中易发生氨基酸的消旋化，为了最大程度地控制消旋化的产生，在DCC 的缩合反应中加入了HOBt、HBTU 组成的复合缩合剂，较好地抑制了消旋化。酰胺键的形成反应尽可能在低温下进行也可抑制消旋化的产生。在本文的设计中，该反应首先在冰浴下进行2 小时，然后在室温下进行， 较好地抑制了消旋化的发生。由于水的存在也可导致消旋化的产生，所以对于所用试剂全部进行了精制，以除去其中的痕量水，抑制消旋化的发生。使用TFA 溶液切脱侧链保护基及树脂肽的过程中，色氨酸的吲哚环在酸解条件下会发生氧化生成氧化吲哚，加入EDA 可以降低氧化副反应。在TFA 中加入苯酚可以增强半胱氨酸的Trt 的脱除效果，捕捉碳正离子酚类，也易于与氧化剂反应。在二硫键的形成过程中，比较了醋酸胺与氨水的空气氧化法。通过实验发现，用奥曲肽的稀溶液，在氨水存在下进行的二硫键氧化过程中，可以防止分子间二硫键的交叉联接，且氧化产率较高；使用醋酸胺的方法会增加产品的冻干难度，且氧化不完全，产率较低。醋酸奥曲肽的制备即奥曲肽的转盐，在文献[45]中采用凝胶层析法进行脱盐和转盐，该法时间长，耗溶剂，收率低，因此开发新的制备醋酸奥曲肽的方法是必要的。在本文的设计中，摸索出了质量法转盐工艺，即将奥曲肽的乙腈洗脱液中加入适量冰醋酸，冻干，得到醋酸奥曲肽冻干粉。采用质量法转盐工艺制备醋酸奥曲肽具有简单、快速、成本低、收率高的特点，适合工业化生产。